多年生短绒野大豆（Glycine tomentella）在我国仅分布于东南沿海地带，2021年被国家列为国家重点保护野生植物，如何合理有效地进行地理居群间取样对该物种遗传多样性地理变异评价和种质资源搜集具有重要意义。本研究从400对物种专有SSR引物中筛选出24对带型稳定的标记，对33个短绒野大豆居群进行SSR分析。利用PCR仪扩增和使用6%聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳检测，结果显示：平均等位基因数变动范围为6-19个，平均11.83个；预期杂合度的范围为0.47-0.928；居群异交率较低（平均0.3%）；居群间遗传变异（22.33%）小于居群内变异（77.13%），平均居群分化系数较低（G_(st)=0.225），有较高水平的基因流（N_(m)=0.608）。空间自相关分析显示，短绒野大豆在125 km距离范围内遗传相关显著。STRUCTURE分析显示33个居群存在2个主要遗传成分背景组别，使用Nei`s遗传距离的NJ聚类划分为3个聚类群，基本上与地理上的北部、中部和南部居群分布相一致。F-统计表明，每个居群都有自己特定的遗传结构。因此，本研究根据该物种仅在我国闽粤狭窄海岸地带分布、居群内较高的遗传变异和居群间显著的遗传差异等特点，建议的取样策略为搜集尽可能多的居群。