工业大麻（Cannabis sativa L.）是一种应用在造纸、医疗保健、纺织等领域的高价值经济作物。创制工业大麻新种质是开展品种选育和功能基因组研究的重要基础。本研究利用甲基磺酸乙酯（EMS）构建了中大麻资4号的突变体群体。通过设置8个EMS诱变剂浓度梯度处理，明确了0.8%EMS处理浓度对中大麻资4号诱变效果最好。对2000粒中大麻资4号种子进行诱变后，M1共成苗644株，萌发率为32.2%，其中包括叶色、花序和株高变异单株90株，突变率为13.98%。对M1突变体进行大麻二酚含量测定，获得3个高大麻二酚和2个低大麻二酚含量突变株；通过测序发现大麻二酚含量突变体中5个大麻素关键催化酶基因（CsPT4、CsOAC1、CsOLS1、CsCBDAS和CsTHCA）及其启动子区域DNA序列均未发生突变，但是大麻二酚含量突变体中以上5个催化酶基因的表达水平较对照出现显著变化。由此推断，EMS处理导致了突变体中影响大麻二酚代谢途径的调控基因突变进而调控大麻二酚合成途径催化酶的表达，最终表现为突变体花头中大麻二酚含量显著变化。本研究通过创制EMS突变体群体为工业大麻育种提供了优异种质资源，也为进一步解析大麻素合成代谢途径的调控机制及挖掘相关基因提供良好材料和基础。