旨在解决传统口蹄疫病毒（FMDV）多克隆抗体ELISA检测中存在的非特异性反应问题，开发针对中国和东南亚地区流行的A型FMDV SEA-97拓扑型毒株的高特异性单克隆抗体的制备与检测方法。通过基于亚洲流行的A型FMDV SEA-97拓扑型毒株的VP1基因，构建重组表达质粒，用原核系统高效表达并纯化VP1蛋白。采用三步筛选策略（间接ELISA初筛、竞争ELISA验证、血清型特异性鉴定），从免疫的BALB/c小鼠中筛选出稳定分泌A型FMDV特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系（10H2-F2），亚型鉴定为IgG1/κ。建立基于单克隆抗体的竞争ELISA，优化抗原包被条件，显著提升检测性能。与O型FMDV及其他9种偶蹄动物病原体（如猪瘟病毒、猪繁殖和呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒、伪狂犬病病毒、蓝舌病病毒、牛病毒性腹泻病毒、羊痘病毒、赤羽病病毒）无交叉反应（抑制率≤22%）；可检测A型FMDV阳性血清256倍稀释样本，较现有方法提升2倍；与血清中和试验的总符合率达97.3%（Kappa=0.945 2）；单克隆抗体在4℃和－20℃保存6个月后抑制率变异系数0.3%，批间重复性优异（F=0.2，P0.8）。所以，建立的竞争ELISA方法具有高度特异性、敏感性及稳定性，为亚洲地区A型FMDV抗体精准检测、疫苗免疫效果评估及疫情监测提供了可靠技术支撑，填补了针对区域性流行毒株的特异性诊断工具的空白。