目的：建立藏药五味甘露药浴汤散高效液相色谱（HPLC）法指纹图谱，并测定黄酮指标成分金丝桃苷、木犀草苷、槲皮苷、槲皮素和穗花杉双黄酮的含量。方法：采用Ultimate XB-C_(18)(250.0 mm×4.6 mm,5.0μm)色谱柱；流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液；梯度洗脱；流速为1 mL/min；检测波长为360 nm；柱温为30℃；进样量为10μL。结果：五味甘露药浴汤散HPLC指纹图谱共标识出16个共有峰，指纹图谱相似度0.99。黄酮指标成分金丝桃苷、木犀草苷、槲皮苷、槲皮素、穗花杉双黄酮分别在4.91～98.10μg/mL(r=1.000 0)、4.93～98.60μg/mL(r=0.999 6)、4.99～99.92μg/mL(r=1.000 0)、2.50～49.80μg/mL(r=0.999 9)、2.48～49.50μg/mL(r=0.999 8)范围内线性关系良好，平均加样回收率（n=6）分别为98.0%(RSD=0.52%)、96.3%(RSD=1.79%)、100.2%(RSD=0.54%)、100.4%(RSD=0.70%)、99.6%(RSD=0.80%)。结论：建立的指纹图谱及多成分含量测定方法专属性强、精密度高、稳定性好，可为提升五味甘露药浴汤散的质量标准提供依据。